Departamento de
Cristalografia

Metodología experimental en
difracción de rayos
X
(monocristal)

Las técnicas usadas para medir
los ángulos y la intensidad de los haces de difracción han evolucionado a lo
largo del tiempo. En el primer experimento de difracción, Friedrich y Knipping
(1912) usaron una película sensible a los rayos X, pero incluso en el mismo año,
Bragg usó una cámara de ionización montada sobre un brazo rotatorio que, en
general, determinaba con más precisión los ángulos y las intensidades de
difracción. Sin embargo, la película presenta la ventaja de poder impresionar
muchos haces difractados a la vez.

Durante los primeros años de la
Cristalografía estructural (desde 1920 hasta 1970) se hizo uso extensivo de los
métodos fotográficos, y entre ellos se deben destacar los métodos de Laue, Weissenberg,
precesión, y
oscilación.

Método de
Laue

En sus primeros experimentos,
Max von Laue (Premio Nobel de Física en 1914) usó
radiación contínua (con todas las longitudes de onda posibles) incidiendo sobre
un cristal estacionario. De este modo, el cristal generaba un conjunto de haces
que representan la simetría interna del cristal. En estas condiciones, y
teniendo en cuenta la ley de Bragg, las constantes del experimento son los
espaciados d y la posición del cristal respecto al haz
incidente, y las variables son la longitud de onda l y el entero n:

n l = 2 dhkl
sen qnh,nk,nl

así que cada haz difractado
corresponderá al primer orden de difracción (n=1) de una
cierta longitud de onda, al segundo orden (n=2) de la
longitud de onda mitad (l/2), al
tercer orden n=3 de la longitud de onda l/3, etc. Por lo tanto, el
diagrama de Laue es simplemente una proyección estereográfica de los planos del
cristal.

Diagrama de Laue de un
cristal

Max von
Laue

Hay dos geometrías diferentes,
dependiendo de la posición del cristal respecto de la placa fotográfica,
transmisión o reflexión:

Método de Laue en modo
transmisión

Método de Laue en modo
reflexión

Método de
Weissenberg

El método de Weissenberg está
basado en la cámara del mismo nombre, desarrollada por K. Weissenberg (1924).
Consta de un cilindro metálico que contiene en su interior una película
fotográfica sensible a los rayos X. El cristal se monta sobre un eje coaxial con
dicho cilindro y se hace girar según el modelo de Ewald, de tal modo que los puntos recíprocos que
intersectan la superficie de la esfera de Ewald son los responsables de los
haces de difracción. Estos haces generan un ennegrecimiento (mancha) sobre la
película fotográfica que cuando se extrae del cilindro metálico tiene la
apariencia que se muestra más abajo.

Esquema de una cámara tipo Weissenberg, usada
en los laboratorios de Cristalografía hasta aproximadamente
1970.

Cámara desarrollada por K. Weissenberg en
1924.

El tipo de diagramas Weissenberg
que se obtienen del modo descrito se denominan de rotación o de oscilación, dependiendo de que el giro del cristal sea
de 360º o parcial (aprox. 20º), respectivamente.

Esquema que explica la producción de un
diagrama de Weissenberg del tipo
rotación-oscilación

El montaje del cristal debe ser
tal que su eje de giro coincida con un eje directo de la celdilla elemental. De
ese modo, por definición de la red recíproca, existirán planos recíprocos
perpendiculares a dicho eje.

Es indudable que mediante este
tipo de diagramas se consigue información sobre los períodos de repetición de la
red directa, ya que la separación entre las líneas que contienen las manchas de
difracción es proporcional a la distancia entre planos recíprocos. Sin embargo,
cada plano recíproco (dos dimensiones) queda sobre una línea (una dimensión) de
manchas de la película, dando lugar a solapamiento entre
manchas.

Este problema quedó resuelto
cuando a las cámaras se les añadió la libertad de traslación del cilindro, en la
dirección paralela a su eje, acoplada al giro del cristal y seleccionando
mediante dos cilindros internos el cono de difracción que origina uno solo de
los planos recíprocos. De este modo, un plano recíproco (dos dimensiones)
quedaría impresionado en toda la superficie de la placa fotográfica (dos
dimensiones), evitando con ello el posible solapamiento entre
manchas.

El aspecto de un diagrama de este tipo, con la deformación
geométrica que se produce del plano recíproco, se muestra en la figura de
abajo. En estas condiciones, y teniendo en cuenta dicha deformación, es posible
medir aisladamente cada haz de difracción, y seleccionando adecuadamente la
rendija se pueden recoger todos los planos recíprocos del
cristal.

Detalle de la cámara de Weissenberg para
separar un cono de haces difractados mediante dos cilindros internos que
dejan una rendija. El cilindro exterior se traslada al mismo tiempo que el
cristal gira, distribuyéndose las manchas de difracción, que antes estaban
en una línea, sobre toda la placa fotográfica.

Diagrama de Weissenberg del plano recíproco
hk2 del metaborato de
cobre.

Método de
precesión

El método de precesión fué
desarrollado por Martin J. Buerger, a principios de la década de 1940, como
alternativa muy ingeniosa para poder impresionar placas fotográficas de planos
recíprocos sin distorsionar. Al igual que el método de Weissenberg, se trata de
un método en el que cristal se mueve, pero el movimiento del cristal (y como
consecuencia el de los planos recíprocos solidarios) es como el de precesión de
los planetas, de ahí su nombre. La película fotográfica se coloca sobre un
soporte plano y se mueve solidariamente con el cristal.

El cristal debe orientarse de tal
modo que el plano recíproco que se desee recoger sea perpendicular al haz
directo de los rayos X, es decir, que un eje directo coincida con la dirección
de los rayos X incidentes.

Dos
visiones esquemáticas del principio en el que se basa la cámara de
precesión. El ángulo m es el ángulo de precesión del plano
recíproco seleccionado del cristal y de la película fotográfica, que se
mantiene paralela al plano recíproco y solidaria en movimientos al
cristal.

La cámara diseñada para tal efecto y el aspecto de un diagrama de
difracción de una muestra inorgánica se muestran en las figuras de abajo.

Esquema y aspecto de una cámara de
precesión.

Diagrama de precesión de una perovskita, con
simetría
cúbica.

Este tipo de diagramas son mucho más simples
de interpretar que los de Weissenberg, ya que muestran el aspecto de un plano
recíproco sin distorsión. La separación de un plano recíproco determinado se
consigue mediante el uso de pantallas (figura de arriba) que seleccionan los
haces difractados de dicho plano. Del mismo modo a como ocurre en el caso de
Weissenberg, se pueden medir las distancias recíprocas y las intensidades de
difracción. Sin embargo, aquí es mucho más facil observar los elementos de
simetría del espacio recíproco. La desventaja del método de precesión es
consecuencia de que la película es plana en lugar de cilíndrica, y el ángulo
sólido explorado es menor.

Este método se ha usado con éxito
durante muchos años, incluso para el caso de las proteínas:

Diagrama de precesión de un cristal de
lisozima en el que fácilmente se distingue un eje de simetría cuaternario
perpendicular al diagrama. Debido a que los ejes de la celdilla elemental
son grandes, la separación entre los puntos recíprocos es
pequeña.

Diagrama de precesión de un compuesto orgánico
sencillo, en el que se observa simetría mm.Obsérvese que la separación
entre los puntos recíprocos es mucho mayor (menores ejes reticulares
directos) que en el caso de las proteínas (mayores ejes reticulares
directos).

Método de
oscilación

Originalmente, los métodos de
monocristal, con giro amplio de la muestra, como los mencionados anteriormente,
se impusieron por su facilidad de interpretación. Sin embargo, cuando se llegó a
experimentar con redes directas grandes, es decir, recíprocas pequeñas, los
tiempos de recogida se disparaban y por lo tanto se recurrió al método de
oscilación con ángulos pequeños, que permitía recoger varios niveles recíprocos
a la vez sobre cada posición del cristal. Repitiendo estos diagramas, a
distintas posiciones de partida del cristal, se conseguían obtener suficientes
datos en un tiempo razonable. La geometría de recogida está descrita en las
figuras que vienen a continuación.

Hoy en día, con generadores de
ánodo rotatorio o sincrotrones, y detectores de área (image plate o CCD,
ver más abajo), que aumentan la intensidad de los máximos de difracción y
reducen los tiempos de recogida con gran fiabilidad, se ha impuesto este método
para los estudios de macromoléculas, en particular de
proteínas.

Esquema de la geometría de las
condiciones de máximo de difracción en el método de oscilación. El
cristal, y por tanto la red recíproca, están oscilando un pequeño ángulo
alrededor de un eje perpendicular al plano de la figura y que pasa por el
centro. En la figura de la derecha, el área que pasa por condición de
máximo de difracción está denotada por el área amarillenta, delimitada por
la esfera de Ewald (de radio 2.sen 90/l)  en
los dos extremos de oscilación de la red, y la esfera de resolución máxima
(de radio 2.sen qmax/l) que se puede alcanzar con la
radiación empleada y con el detector que se haya
usado.

Cuando
la red recíproca oscila un pequeño ángulo, alrededor del eje de giro,
pequeñas zonas de los diferentes niveles de la red recíproca entran en
contacto con la esfera de Ewald, alcanzando las condiciones de máximo de
difracción. De este modo, sobre la pantalla del detector, la geometría de
oscilación produce máximos de difracción procedentes de diferentes niveles
de la red recíproca y formando lúnulas sobre el diagrama (figura de la
derecha).

Goniometría
de cuatro círculos

La introducción de los
computadores digitales a finales de la década de 1970, permitió el diseño de los
llamados difractómetros automáticos de cuatro
círculos. Estos equipos, disponen de un sistema goniométrico, con una
mecánica muy precisa, que mediante tres giros permite colocar el cristal en
cualquier orientación del espacio, provocando así que se cumplan los
requerimientos de la construcción de Ewald para que se produzca la difracción.
En estas condiciones, un cuarto eje de giro, que sustenta el detector
electrónico se coloca en condiciones de recoger el haz difractado. Todos estos
movimientos se pueden programar para que se realicen de un modo automático, con
una mínima intervención del operador.

Entre este tipo de goniómetros se
pueden distinguir dos geometrías goniométricas que se han usado con excelente
éxito durante muchos años. En el goniómetro de geometría
Euleriana (ver figura de abajo) el cristal se orienta mediante los
tres ángulos de Euler, f
que representa el giro
sobre el eje de la cabeza goniométrica, c que le
permite el balanceo sobre el círculo cerrado, y w que permite el giro total del goniómetro. El cuarto círculo lo
representa el giro del detector, 2q. Esta
geometría, presenta la ventaja de la estabilidad mecánica, pero por contra
restringe la accesibilidad al cristal para equipos externos de baja o alta
temperatura.

Esquema y aspecto de un goniómetro de cuatro
círculos con geometría Euleriana.

Movimientos de un goniómetro de cuatro
círculos con geometría Euleriana.

(imagen
cedida por  Seifert Analitical Systems)

(Si no
observa movimiento, por favor, recarge la
página)

La geometría alternativa a la
Euleriana es la denominada geometría Kappa que
no dispone de un círculo cerrado equivalente al c. En su lugar, su función la cumplen los
llamados ejes k y
wk, de tal modo que con una combinación de ambos se pueden obtener
c eulerianos en el intervalo de -90 a +90º. La
ventaja principal de esta geometría es la amplia accesiblidad al cristal. Los
ángulos f
y 2q son idénticos al los de la geometría
euleriana:

Esquema y aspecto de un goniómetro de cuatro
círculos con geometría
Kappa.

Tanto en la geometría Euleriana como Kappa,
el sistema de detección ampliamente usado durante muchos años es el denominado
"puntual", en el sentido de que la detección de cada haz difractado (reflexión)
se realiza de modo individual, necesitando cambiar, de modo automático y
programado, los cuatro valores angulares del goniómetro para cada haz
difractado. Los tiempos de medida en estos equipos suele ser del orden de 1
minuto por reflexión.

Uno de los detectores más
ampliamente usados ha sido el denominado detector de centelleo, cuyo esquema de funcionamiento es el
siguiente:

Detectores de
área

Como alternativa a los detectores
"puntuales", el desarrollo de la tecnología electrónica ha dado lugar a la
aparición de los denominados detectores de
área, que permiten la detección de muchos haces de difracción
simultáneamente, ahorrando con ello tiempo en el experimento. Esta tecnología es
de especial utilidad para el caso de las proteínas y en general de cualquier
material que pueda deteriorarse durante su exposición a los rayos X, ya que la
detección de cada una de las imágenes que se recogen (con varios cientos o miles
de reflexiones) se hace en un tiempo mínimo, del orden de los
segundos.

Uno de los detectores de área mas
comunmente usado se basa en los denominados CCD's (del inglés Charge Coupled Device) cuyo
esquema se muestra a continuación:

Esquema de un CCD con indicación de sus componentes principales.El
conversor de rayos X (D en la figura) es un material sensible, del tipo P,
GdOS, etc., que es capaz de convertir los rayos en pulsos eléctricos. Los
CCD's operan a una gran velocidad de conversión, aunque su desventaja es
la de operar a muy bajas temperaturas (del orden de -70
ºC).

Los detectores del tipo CCD se instalan normalmente sobre equipos goniométricos
con geometría Kappa y por su rapidez su uso
está ampliamente extendido en el ámbito de la Cristalografía de proteínas,
asociados a generadores de ánodo rotatorio o en las grandes instalaciones
de sincrotrón.

Goniómetro de geometría Kappa con detector
tipo CCD.
(Imagen tomada de
Bruker-Nonius)

Detalle del montaje de un goniómetro
con geometría Kappa (aunque con ángulo k
fijo)

Otro tipo de detectores de amplio
uso hoy en día, especialmente en la Cristalografía de proteínas es el llamado
Image Plate Scanner que generalmente se montan
sobre un goniómetro relativamente rudimentario, cuya única libertad de giro
corresponde a la del cristal sobre su eje de montaje. El detector propiamente
dicho es una placa circular de material sensible a los rayos X que se
interpreta, después de la exposición, mediante un laser capaz de digitalizar las
intensidades.

Image Plate
Scanner.
(Imagen tomada de
Mar
Research)

Detalle de un detector del tipo Image Plate
Scanner

La recogida de un espectro
completo consiste en la obtención de multitud de imágenes como la que se muestra
más abajo, y que posteriormente son analizadas para obtener la métrica, simetría
e intensidades del espacio recíproco.

Aspecto de una de las imágenes de difracción, del tipo oscilación,
de una proteína recogida en un Image Plate Scanner. Durante la exposición
de cada una de estas imágenes (unos 10 minutos con un generador de ánodo
rotatorio, o de varios segundos en una instalación de sincrotrón) el
cristal gira aproximadamente 0.5º y la lectura de la imagen dura unos 30
segundos.

Este
podría ser también el aspecto de una imagen de difracción recogida en un
detector de tipo CCD, aunque en este caso probablemente la duración de la
exposición habría sido algo más
corta.

Todos estos métodos permiten
obtener una colección de datos, formados por tres índices de Miller y una
intensidad para cada uno de los máximos de difracción medidos. Con ello se
consigue recoger la mayor parte posible de la red recíproca, ponderada con
intensidades, es decir, el espectro de difracción de un monocristal de la
muestra a estudiar.

Estos datos nos permitirán
reconstruir la arquitectura interior del cristal, pero eso será objeto de otro
capítulo ...

Al siguiente apartado
sugerido:  (en construcción)

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