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Equipo Interdisciplinar: Grupo de Experimentación Innovativa e Instrumental – FCEIA - UNR

Los polímeros derivados del petróleo se encuentran muy diseminados en el mercado. Sin embargo, se producen a partir de recursos no renovables y se caracterizan por la dificultad en su descarte, siendo el reciclaje y la reutilización opciones no factibles. El ácido poli β-hidroxibutírico (PHB) constituye un buen ejemplo de polímero termoplástico proveniente de recursos renovables y presenta a su vez una gran ventaja: la de ser biodegradable. Su aplicación se ve limitada por los altos costos en su producción. En el presente proyecto se propone usar aguas residuales y lodos activados como fuentes renovables de carbono y biomasa, respectivamente, para producir PHB de manera más económica. Se evaluarán también distintas condiciones experimentales para determinar cuáles brindan mejores rendimientos.

Los plásticos que se utilizan actualmente presentan varios inconvenientes. Por un lado, son producidos a partir de recursos no renovables como los petroquímicos, y por el otro, no son compatibles con el ciclo natural del carbono debido a su naturaleza no biodegradable. Su degradación solo llega hasta la etapa de fragmentación, dando como resultado fragmentos pequeños y entrecruzamientos entre ellos. Esto trae aparejado la formación de residuos más persistentes y difíciles de tratar causando serios problemas a los escenarios naturales y la vida silvestre [1, 2].

Entre los años 1960 y 2000 la producción de plásticos se incrementó 25 veces, mientras que la reutilización del material se mantuvo por debajo de un 5%. La tendencia actual es que la mayoría de los bienes sean de plástico o estén envueltos con ellos, mientras que la recuperación no provee ganancias significativas ni opciones para la reutilización de los mismos. Esto ha llevado a que el plástico se convierta en el contaminante de mayor crecimiento entre los desechos. No sólo se ha perjudicado el aspecto de los escenarios, sino que los ecosistemas están siendo peligrosamente alterados. El ecosistema marino constituye un claro ejemplo de esto: como el océano se encuentra por debajo y corriente abajo de prácticamente todos los asentamientos humanos, y la mayoría de estos asentamientos están próximo a él, muchos plásticos terminan en el mar. De hecho se sabe que el 44% de las especies de aves marinas se ven afectadas al ingerir plásticos que confunden con alimentos [3].

Todo esto motivó la realización de investigaciones en torno al desarrollo de biopolímeros que fueran amigables con el ambiente, es decir, biodegradables. Esto significa que los fragmentos resultantes de la degradación sean utilizados por microorganismos como fuente de carbono y de energía, produciendo CO₂, H₂O y humus (ver Figura 1) [2].

Entre la gran variedad de estos plásticos biodegradables, una familia de más de 40 poli-hidroxi alcanoatos (PHAs) y sus derivados copoliméricos ha surgido como una alternativa atractiva debido a su completa biodegradabilidad. Los PHAs son poliésteres alifáticos lineales compuestos de monómeros de ácidos grasos y ácido poliláctico. Pueden ser sintetizados de diferentes maneras: (i) microorganismos silvestres o recombinantes, (ii) producción in vitro por la PHA-polimerasa, (iii) usando plantas modificadas genéticamente o (iv) por digestión de desechos biológicos. El ácido poli β-hidroxibutírico (PHB) es el PHA más estudiado. Tiene propiedades muy similares a las de los plásticos derivados del petróleo (como el propileno) y, como el resto de los PHAs, es completamente biodegradable en el ambiente. Como su producción y extracción genera una menor contaminación en comparación con la de los polímeros sintéticos, el uso de este es, de manera global, mucho menos perjudicial [4]. Por tales motivos, el PHB es el candidato elegido para reemplazar los plásticos convencionales [5]. Muchas bacterias lo producen y acumulan como reserva de carbono, en forma de gránulos, al encontrarse en condiciones nutricionales y ambientales desfavorables (ver Figura 2) [6, 7].

Figura 2: Poli-ß-hidroxibutirato (PHB). (a) Estructura química del PHB, un poli-ß-hidroxialcanoato muy común. Se indica cada unidad monomérica. En otros polímeros de alcanoatos, el grupo –CH₃sobre el carbono se sustituye por cadenas hidrocarbonadas más largas.

(b) Micrografía electrónica de cortes finos de la bacteria fototrofa Rhodovibrio sodomensis mostrando gránulos de PHB.

Sin embargo, la producción de PHB es diez veces más costosa en comparación con la de los plásticos sintéticos, ya que involucra la generación de biomasa por medio de fuentes de carbono muy caras. Esto ha limitado el uso del PHB a áreas especializadas de la cirugía y la medicina. Los esfuerzos por reducir dichos costos están enfocados a incrementar el contenido de PHB desarrollando cepas bacterianas más aptas y sistemas de fermentación y recuperación más eficientes [5].

Por otra parte, se ha evidenciado la presencia de PHA en lodos activados, como producto metabólico intermediario en el tratamiento de aguas residuales [1]. El lodo activado es el material biológico producido en el tratamiento de aguas residuales. Este tratamiento consiste en combinar aguas residuales con microorganismos para reducir la carga orgánica de las aguas. A esta combinación se le llama licor mixto. Una vez que el agua ha recibido suficiente tratamiento, el exceso de licor se descarga en tanques de sedimentación. Luego de un período en estos tanques, se puede separar el sobrenadante del lodo. El sobrenadante continúa siendo tratado antes de descargarse, mientras que parte del lodo sirve para resembrar las nuevas aguas sin tratar y otra parte representa el exceso de lodo activado. El exceso del lodo se extrae del sistema para mantener la relación biomasa-sustrato balanceada [8].

Consideramos relevante analizar la posibilidad de producir PHB utilizando el exceso de lodo activado de una planta de tratamiento de efluentes y las aguas residuales derivadas de la industria agrícola y alimenticia como fuentes renovables y económicas de biomasa y carbono, respectivamente. Esto presentaría dos grandes ventajas: por un lado, una reducción en el costo de producción de PHB, y por el otro, una disminución del volumen del lodo activado de descarte, como resultado de la extracción del PHB.

¨ Reducir el volumen del lodo activado de descarte, como resultado de la extracción del PHB.

¨ Encontrar las condiciones más adecuadas para la aclimatación de los lodos activados y su enriquecimiento en bacterias productoras de PHB.

¨ Determinar las condiciones óptimas de producción de PHB, utilizando aguas residuales de distinta composición.

El sistema de producción de PHB a partir de aguas residuales está representado en la Figura 3.

Este proceso puede ser dividido en dos grandes etapas: la producción de biomasa y la producción de PHB. Para la primera etapa, en un reactor secuencial en batch (SBR, de Sequencing Batch Reactor) se introducen el agua residual y el lodo activado. A su vez, se burbujea aire utilizando una bomba y un difusor. Todo esto es homogeneizado por un mezclador de paletas (ver Figura 4).

El lodo activado contiene varios tipos diferentes de microorganismos. Además de bacterias productoras de PHB, muchos otros organismos predadores que no lo producen habitan en las plantas de tratamiento de aguas residuales, como por ejemplo, ciliados, rotíferos y nematodos, entre otros. Por esta razón es que se quiere enriquecer selectivamente la biomasa bacteriana, de modo que la presencia del resto de los microorganismos se vea minimizada [6]. Con este fin se introducen en el biorreactor los siguientes elementos: CH₃COOH, (NH₄)₂HPO₄, K₂HPO₄, MgSO₄.7H₂O; y soluciones de elementos traza: Na₂SO₄, FeSO₄.7H₂O, MnSO₄.4H₂O, ZnSO₄.7H₂O, CuSO₄.5H₂O y CaCl₂.2H₂O [5]. Este lodo enriquecido selectivamente puede ser utilizado como fuente de biomasa productora de PHB de bajo costo.

Para evaluar su grado de enriquecimiento y aclimatación en función del pH, tiempo de retención y concentración de acetato, sólo se varía uno de los parámetros mientras que el resto se mantiene constante. Para establecer el pH se agregan diferentes volúmenes de H₂SO₄ ó NaOH diluidos, hasta llegar a valores de 7 u 8. También se determinan el efecto del tiempo de retención en el biorreactor y, por otro lado, la variación de las concentraciones de acetato. Los tiempos de retención a evaluar serán de 3 y 10 días, mientras que las concentraciones de acetato, 5 mg/L y 30 mg/L. Esto se resume en la siguiente tabla:

Condición de operación	pH	Alimentación	Tiempo de retención (días)
Concentración de acetato en la alimentación	7	Agua residual municipal suplementada con 5 mg/L	5
Concentración de acetato en la alimentación	7	Agua residual municipal suplementada con 30 mg/L	5
pH	7	Agua residual municipal	5
pH	8	Agua residual municipal	5
Tiempo de retención	7	Agua residual municipal	3
Tiempo de retención	7	Agua residual municipal	10

Para la segunda etapa, correspondiente a la producción de PHB, se utiliza un reactor en batch más pequeño que el anterior, el cual se esquematiza en la Figura 5. Se agregan los distintos lodos obtenidos en la primera etapa junto con las aguas residuales. En un primer caso, se evalúa la producción de PHB en función del tipo de lodo usado y en el otro, la producción de PHB en función del lodo y de la fuente de carbono (aguas residuales sometidas a distintos tratamientos).

b) Tipo II o filtrada: aguas residuales en las cuales los sólidos en suspensión son removidos por filtración.

c) Tipo III o deproteinizada: aguas residuales en las que el pH es ajustado a 7 y que se hierven para precipitar las proteínas. Estas son removidas por centrifugación, y el sobrenadante es luego filtrado.

El tipo I se emplea en el primer caso, mientras que los tipos II y III se emplean en el segundo. Cada uno de los tratamientos se lleva a cabo para reducir el contenido de nitrógeno y así aumentar la relación C:N en las aguas residuales. Esto podría resultar en un aumento en la producción de PHB, ya que bajo condiciones limitantes de nutrientes es posible que las bacterias cambien la síntesis proteica por la síntesis de polímeros de reserva, como el PHB, como estrategia de supervivencia.

Concluida la producción de PHB, se procede a la extracción del polímero contenido en las células bacterianas y se determina su concentración. La biomasa es aislada por centrifugación y posteriormente se lava con acetona y etanol para remover impurezas. Esto es seguido de la lisis celular causada por el agregado de NaCl 5%. EL PBH liberado es extraído con cloroformo caliente y separado de los restos celulares por filtración. Luego de esto, se realiza un análisis de H¹-NMR para corroborar la presencia de PHB.

Finalmente, la concentración de PHB se determina espectrofotométricamente por el método de Law y Slepecky, expresando el resultado obtenido como porcentaje del peso seco de biomasa (% w/w) [5].

A fin de encontrar las condiciones más adecuadas para la aclimatación de los lodos activados y su enriquecimiento en bacterias productoras de PHB, se procederá a:

§ META 1: Evaluar el grado de enriquecimiento y aclimatación de los lodos a distintos valores de pH.

§ META 2: Evaluar el grado de enriquecimiento y aclimatación de los lodos a diferentes tiempos de retención.

§ META 3: Evaluar el grado de enriquecimiento y aclimatación de los lodos a diversas concentraciones de acetato.

§ META 4: Evaluar el rendimiento en la producción de PHB con los distintos lodos obtenidos en la primera etapa.

§ META 5: Evaluar el rendimiento en la producción de PHB con los distintos lodos, utilizando aguas residuales de distinta composición (distintos cocientes C:N).

	1^era Etapa	2^da Etapa	3^era Etapa	4^ta Etapa	5^ta Etapa	6^ta Etapa
META 1			X
META 2	X
META 3		X
META 4				X
META 5					X	X

§ Aportar una solución viable a la problemática derivada del uso indiscriminado de los plásticos sintéticos, apuntando principalmente a reducir el costo en la producción de PHB. Esto último se sustenta en los siguientes puntos previstos:

a) la optimización de las condiciones operacionales que incrementan la capacidad de producción de PHB de los lodos activados.

b) la reducción en los costos de generación de biomasa productora de PHB, como consecuencia directa del uso de los cultivos bacterianos mixtos presentes en los lodos activados, una fuente de biomasa económica y renovable. Se espera de este modo poder sustituir los cultivos puros de bacterias, más costosos.

c) la reducción en los costos de los sustratos carbonados, como consecuencia directa de la utilización de aguas residuales derivadas de la industria agrícola y alimenticia, una fuente de carbono económica y renovable.

d) la reducción en los costos de los equipos empleados en los sistemas de producción de PHB.

§ Disminuir la cantidad de lodo activado desechado, derivado del tratamiento de aguas residuales, por medio de la extracción de PHB. Esto implica:

a) recuperar materiales útiles a partir de los desechos, obteniendo productos de alto valor agregado (tanto económico como ambiental).

b) generar un importante ahorro en los costos de eliminación de los lodos activados de descarte, haciendo el proceso global aún más rentable.

Realizando los estudios de obtención de PHB a partir de aguas residuales y lodos activados, se podrán determinar las condiciones que generan mejores rendimientos. A su vez, estos conocimientos servirán de punto de partida para futuras investigaciones que evalúen distintas variables, como el microorganismo o la fuente de carbono a emplear. Se logrará entonces dar un fuerte impulso a los proyectos de investigación orientados a:

• la identificación y caracterización de los distintos grupos de genes que participan tanto en la regulación como en la síntesis y degradación del PHB. De esta manera, será posible dilucidar la red de vías metabólicas subyacente, una herramienta clave para la construcción y el análisis molecular de mutantes utilizadas en los procesos de fermentación para la producción de PHB.

• el análisis de los mecanismos moleculares mediante los cuales el PHB favorece la adaptabilidad bacteriana en condiciones de estrés. Este conocimiento puede aplicarse a su vez a la optimización de los métodos de producción de PHB.

• la prospección de genes en diversas regiones de nuestro país, basada en el hecho de que el conocimiento de la diversidad bacteriana que de ella se desprende contribuye al uso racional y sostenible de los recursos naturales y a la preservación de los ecosistemas asociados.

De este modo, se espera aportar al conocimiento básico y aplicado, optimizando los procesos de fermentación y las cepas bacterianas a emplear.

Como resultado de la optimización del proceso productivo y de la utilización de fuentes económicas de biomasa y sustrato, se reducirá el costo de producción de PHB, de manera que pueda competir en el mercado con los plásticos derivados del petróleo. Asimismo, se podrá generar un importante ahorro en los costos de eliminación de los lodos activados de descarte.

A largo plazo, este proyecto podría motivar a las personas a cuidar el medio ambiente, con una consecuente mejora de su calidad de vida.

Los polímeros biodegradables representan una solución atractiva a la problemática ocasionada por el uso de plásticos convencionales. Por medio de una evaluación de los ciclos de vida (LCA, del inglés life cycle assessment), puede demostrarse que la producción y extracción del PHB genera una menor contaminación en comparación con la de los polímeros sintéticos. La realización de este proyecto contribuirá al reemplazo de estos últimos.

Por otra parte, teniendo en cuenta las fuentes de sustrato y biomasa utilizadas, se logrará reducir el exceso de lodo activado producido durante el tratamiento de aguas residuales.

[1] Chua, A., Takabatake, H., Satoh, H., Mino, T. Production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by activated sludge treating municipal wastewater: effect of pH, sludge retention time and acetate concentration in influent. Water Res. 37, 3602-3611, 2003.

[2] Mohee, R., Unmar G.D., Mudhoo, A., Khadoo, P. Biodegradability of biodegradable/degradable plastic materials under aerobic and anaerobic conditions. Waste Man. 28, 1624-1629, 2008.

[3] Moore, C.J. Synthetic polymers in the marine environment: A rapidly increasing, long-term threat. Environmental Research 108, 131–139, 2008.

[4] Harding, K.G., Dennis J.S., von Blottnitz H., Harrison, S.T.L. Environmental analysis of plastic production processes: Comparing petroleum-based polypropylene and polyethylene with biologically-based poly-β-hydroxybutyric acid using life cycle analysis. Journal of Biotech. 130, 57–66, 2007.

[5] Khardenavis, A.A., Suresh Kumar, M., Mudliar, S.N., Chakrabarti, T. Biotechnological conversion of agro-industrial wastewaters into biodegradable plastic, poly β-hydroxybutyrate. Bioresource Tech. 98, 3579-3584, 2007.

[6] Suresh Kumar, M., Mudliar, S.N., Reddy, K.M.K, Chakrabarti, T. Production of biodegradable plastics from activated sludge generated from a food processing industrial wastewater treatment plant. Bioresource Tech. 95, 327-330, 2004.

[7] Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. Brock Biología de los microorganismos, 8^va Ed. Editorial Prentice Hall, Madrid.

[9] http://5gyres.org/ - Understanding Plastic Pollution through Exploration, Education and Action.